Podzbiór neutrofilów w ludzkim ogólnoustrojowym zapaleniu hamuje odpowiedź komórek T poprzez Mac-1 czesc 4

Dane przedstawiono jako względną produkcję IFN-y lub IL-13 w porównaniu z jedynie PBMC (średnia . SEM; n = 6). (E. G) Procent IFN-. i komórki T wytwarzające IL-4. zmierzono przez wewnątrzkomórkowe barwienie cytokinami. PBMC wybarwiono pod kątem CD4 / CD8 i wewnątrzkomórkowego IFN-y. i IL-4 po 2 dniach kokultury Przedstawiono (E) procent IFN-y lub (F) limfocytów wytwarzających IL-4 (3. Dane są przedstawione jako średnie. SEM; n = 4. Przykład barwienia jest pokazany na G. Liczby wskazują procenty komórek w każdej bramce. * P <0,05. Limfocytów T indukowanych neutrofilem CD62Ldim / CD11c bright wymaga neutrofili Mac-1. W modelach mysich supresja limfocytów MDSC w komórkach może być mediowana przez arginazę I. L-arginina wykazała hamowanie działania supresji zależnej od arginazy I (22). Jednak superrafizjologiczne stężenia l-argininy nie wpływały na supresję wywołaną przez neutrofile CD62Ldim. To pokazało, że arginaza I nie była stosowana do supresji limfocytów T przez ten podzbiór neutrofili CD62Ldim (Figura 5A). Pokazano również, że neutrofile wydzielają IL-10 i TGF-a, które odgrywają ważną rolę w supresji limfocytów T. Jednak antagonizm tych czynników nie ujawnił żadnej roli tych cytokin w naszym systemie (Figura 5A). Następnie zbadaliśmy, czy potrzebny jest bezpośredni kontakt między limfocytami i neutrofilami CD62Ldim, stosując system transwell oddzielający zawiesiny komórek. W tym systemie granulocyty obojętnochłonne straciły swoją zdolność tłumienia w porównaniu z neutrofilami, które nie zostały rozdzielone, co wskazuje, że potrzebna jest bliskość komórkowa między neutrofilami i limfocytami (Figura 5B). Figura 5 Mechanizm indukowanej neutrofilami supresji proliferacji komórek T. (A) Rozpuszczalne mediatory hamowania komórek T. Limfocyty obojętnochłonne CD62Ldim dodano w stosunku 2: do stymulowanych PHA (10 .g / ml) PBMC w obecności lub nieobecności anty-IL-10 (5 .g / ml), TGF-a. inhibitor LAP (1 .g / ml) lub 1-argininę (1 mM). Dane są przedstawione jako średnie. SEM z 5 niezależnych eksperymentów. (B) Rozdzielenie neutrofili CD62Ldim i PBMC. Neutrofile i limfocyty T rozdzielono przez membranę stosując system Thinsert (MS). Neutrofile umieszczono w górnym przedziale w stosunku 2: 1, a PBMC umieszczono w niższej. Dane te porównano z nierozdzielonymi neutrofilami i PBMC (a). Dane są wyrażone jako średnie. SEM 4 indywidualnych eksperymentów. (C) Limfocyty obojętnochłonne CD62Ldim dodano w stosunku 2: do stymulowanych PHA (10 .g / ml) PBMC w obecności lub nieobecności przeciwciała blokującego 44a (10 .g / ml) Mac-l / i / lub katalazy ( 4000 U / ml). Jako kontrolę, 44a i katalazę dodano również do PBMC bez dodawania neutrofili; dane zostały poprawione dla tej kontroli. Dane są przedstawione jako średnie. SEM z 7 niezależnych eksperymentów. (D) Kokultury zawierały PBMC z lub bez sortowanych fragmentów neutrofilów lub neutrofilów FACS sprzed LPS (t = 0). Kokultury stymulowano PHA (10 .g / ml) i inkubowano w pożywce hodowlanej zawierającej Amplex Red (25 .M) i HRP (0,25 U / ml). Fluorescencję po redukcji czerwieni Amplex mierzono przez 8 godzin. Jako kontrolę pozytywną do hodowli dodano PAF (10. 6 M) i fMLF (10. 6 M). Przedstawiono jeden reprezentatywny eksperyment 3. * P <0,05. Oprócz arginazy I, ROS są zaangażowane w immunosupresję MDSC (23). Produkcja O2. przez związaną z błoną oksydazę NADPH jest podstawową funkcją przeciwdrobnoustrojową neutrofili (24). Stwierdzono, że H2O2, który jest metabolitem w dół od O2a, moduluje odpowiedzi komórek T poprzez różne mechanizmy (25, 26). W związku z tym zbadaliśmy, czy produkcja H2O2 przyczyniła się do supresyjnego działania tego podzestawu neutrofili. Rzeczywiście, katalaza wymiatająca H2O2 była w stanie częściowo odzyskać hamowanie supresji limfocytów T o 20% po dodaniu do współhodowli (Figura 5C). Następnie, ponieważ granulocyty obojętnochłonne są zdolne do wytwarzania dużych ilości nadtlenku wodoru, zbadaliśmy, czy zahamowanie proliferacji limfocytów T było spowodowane masowym uwalnianiem H2O2. Kokultury uzupełniono sondą fluorescencyjną Amplex Red, która służy do wykrywania pozakomórkowego H2O2. W tych hodowlach nie zaobserwowano pozakomórkowego uwalniania H2O2 (Figura 5D). Jako kontrolę PAF / fMLF dodano do współhodowli, które pokazały, że pomimo małej liczby neutrofili w hodowlach można wykryć pozakomórkowe uwalnianie H2O2 (Figura 5D). Konieczność bliskości komórek neutrofilów i limfocytów T, jak zaobserwowano w teście transwell, oraz zdolność katalazy do zapobiegania supresji, w połączeniu z brakiem ogólnego środowiska oksydacyjnego, skłoniły nas do postawienia hipotezy, że neutrofile lokalnie dostarczają H2O2 do komórek T [podobne: tabletki na przyrost masy, badanie elektrofizjologiczne, nyda opinie ] [więcej w: nużeniec ludzki objawy, isoprinosine cena, nyda opinie ]