Podzbiór neutrofilów w ludzkim ogólnoustrojowym zapaleniu hamuje odpowiedź komórek T poprzez Mac-1 ad

Jak wcześniej opisano, indukowano znaczną neutrofilię. W 3 godziny po podaniu LPS pula krążących neutrofili składała się z co najmniej 3 fenotypów morfologicznych (Figura 1A, prawy panel). W tym momencie w krążeniu pojawiły się paskowe neutrofile (CD16dim / CD62Lbright), najprawdopodobniej uwolnione ze szpiku kostnego. Równolegle w krążeniu wykryto neutrofile CD16Light / CD62Ldim, wykazujące hipersegmentową morfologię jądrową. Komórki CD16dim / CD62Lbright i CD16bright / CD62Limim nie znaleziono u zdrowych dawców przed podaniem LPS (Figura 1A, lewy panel). Populacje te stanowiły odpowiednio 20% . 25% i 10% . 15% wszystkich krążących krwinek białych obojętnochłonnych (Figura 1B). Trzecia populacja, komórki CD16bright / CD62Light, wpadła do tej samej bramki, co normalne komórki w lewym panelu na Figurze 1A. Ponieważ występowała znaczna neutrofilia, podzbiory CD16dim i CD62Ldim zawierały istotną absolutną liczbę krążących leukocytów (Figura 1C). Figura 1Neutrofilowe podzbiory po podaniu LPS. (A) Neutrofile wybarwiono dla CD16 i CD62L przed i 180 minut po podaniu LPS. Przed podaniem LPS neutrofile tworzyły jedną populację; komórki CD16low są eozynofilami. W 180 minut po podaniu LPS zidentyfikowano 2 odrębne podzestawy neutrofili. Podzbiory były sortowane FACS, a cytospiny były wytwarzane i barwione May-Grunwaldem Giemsa. Oryginalne powiększenie, × 100. (B) Neutrofile wybarwiono dla CD16 i CD62L w różnych punktach czasowych; punkt czasowy 0 jest przed wyzwaniem LPS. Procenty podzbiorów neutrofili obliczono na podstawie danych z cytometrii przepływowej. Dane są wyrażone jako średnie. SEM; n = 7. (C) Obliczono bezwzględne liczby podzbiorów neutrofili przy użyciu procentu podzbiorów i bezwzględnej liczby neutrofili (średnia . SEM; n = 7). Charakterystyka podzbiorów neutrofili po podaniu dożylnym LPS. Przedstawione podzbiory neutrofili wykazały różnice w wyrażaniu markerów powierzchniowych. Neutrofile CD62Ldim wykazywały zwiększoną ekspresję CDllb, CDllc i CD54, ale równą ekspresję CD88 w porównaniu z neutrofilami CD16dim (Figura 2A). Tabela uzupełniająca (materiał uzupełniający dostępny online w tym artykule: doi: 10.1172 / JCI57990DS1) pokazuje ekspresję 20 dodatkowych oznaczonych markerów. Limfocyty obojętnochłonne CD62Ldim wykazywały wyższą ekspresję większości markerów powierzchniowych w porównaniu z innymi podzbiorami neutrofili. Regulacja w górę ekspresji CD11b na tej subpopulacji może być spowodowana aktywacją komórkową indukowaną przez podawanie LPS, ponieważ ta integryna jest wrażliwa na. i jest szybko indukowany przez. rozpuszczalne bodźce. Bardziej rygorystycznym markerem dla aktywowanych komórek jest ICAM-1 (CD54), ponieważ jest to głównie stwierdzane na wynaczynionych neutrofilach (21), a in vitro jest regulowane w górę tylko po przedłużonej stymulacji cytokiną (dane nie przedstawione). Figura 2 Fenotyp nukocytów obojętnych po podaniu LPS (A) Neutrofile wybarwiono dla CD16 i CD62L w celu rozróżnienia między podzbiorami. Dodatkowo barwiono je CD11b, CD11c, CD54 i CD88. Przedstawiono średnią intensywność fluorescencji. Czerwone linie przedstawiają CD16bright / CD62Ldim; szare linie przedstawiają CD16bright / CD62Lbright; zielone linie przedstawiają CD16dim / CD62Lbright. Wykresy są reprezentatywne dla 5 eksperymentów. (B) Przeżywalność neutrofilów po 24 godzinach. Podzbiory neutrofilów sortowano FACS i komórki inkubowano przez 24 godziny w 37 ° C, 5% CO2; po inkubacji barwiono je aneksyną V PE przez 15 minut i mierzono za pomocą cytometrii przepływowej. Dane wyrażono jako procent komórek Vivy zawierających aneksyny V ujemne (średnia . SEM; n = 5). (C) Względny wzrost H2O2 w niesortowanych neutrofilach mierzony za pomocą cytometrii przepływowej z DHR. Podzbiory neutrofilów są wizualizowane za pomocą barwienia CD16 i CD62L. Komórki stymulowano za pomocą fMLF (10. 6 M) i PAF (10. 6 M) przez 15 minut. Jako kontrolę stosowano neutrofile ze zdrowych kontroli. Wykres pokazuje względny wzrost uwalniania H2O2 (średnia . SEM; n = 7). ** P <0,005; *** P <0,001. Oprócz różnic w ekspresji markerów powierzchniowych te 2 odrębne populacje wykazują również niejednorodność funkcjonalną. Limfocyty obojętnochłonne CD16dim wykazywały wyższy wskaźnik przeżycia po 24 godzinach w hodowli w porównaniu z neutrofilami CD62Ldim, które wykazywały podobny, szybki wskaźnik apoptozy do prawidłowych (t = 0) neutrofili (Figura 2B). Aktywacja oksydazy NADPH, zmierzona przez pozakomórkowe wytwarzanie H2O2, była około 3-krotnie wyższa w neutrofilach CD62Ldim w porównaniu z neutrofilami z kontrolnej neutrofili i podziałem neutrofili CD16dim po stymulacji ex vivo czynnikiem aktywującym płytki (PAF) i N-formylem. -metylosilulcylo-fenyloalanina (fMLF) (Figura 2C). Neutrofile CD62Ldim / CD11cbright tłumią aktywację limfocytów. Ponieważ zarówno myszy jak i ludzkie populacje MDSC zostały opisane jako zawierające neutrofile (1), zbadaliśmy zdolność naszych odrębnych populacji neutrofili do tłumienia ph [przypisy: tabletki na erekcję bez recepty, jak przygotować się do badania usg jamy brzusznej, taniec użytkowy kroki ] [przypisy: relewium, ada obrazy, aromactiv plastry ]