Podzbiór neutrofilów w ludzkim ogólnoustrojowym zapaleniu hamuje odpowiedź komórek T poprzez Mac-1 ad 9

Ponadto wyizolowane neutrofile i PBMC inkubowano w 96-studzienkowej płytce w obecności PHA (10 | ag / ml), Amplex Red (25 | jM) i HRP (0,25 U / ml). Wytwarzanie fluorescencyjnego rezorufiny, wytworzonego z Amplex Red w obecności HRP po peroksydacji, zmierzono podczas 8 godzin w 37 ° C przy użyciu fluoro-luminometru FluostarOptima (BMG LABTECH). Proliferacja komórek T. Eksperymenty przeprowadzono w pożywce do hodowli IMDM uzupełnionej 5% połączoną ludzką surowicą AB (Cambrex), penicyliną (100 IU / ml, Gibco, Invitrogen), streptomycyną (100 mg / ml, Gibco, Invitrogen) i glutaminą (1 mM; Invitrogen). Proliferację po 96 godzinach mierzono przez ocenę włączenia [3H] tymidyny (1 mCi / studzienkę [Amersham]); [3H] tymidynę dodano podczas ostatnich 18 godzin hodowli. Odpowiedzi proliferacyjne wyrażono jako średnią inkorporację [3H] tymidyny, którą mierzono jako zliczenia na minutę z potrójnych studzienek. Do eksperymentów rozpuszczalności zastosowano Thinserts (Greiner), 24-studzienkowe wstawki o wielkości porów 0,4. M. W doświadczeniach z inhibitorami lub przeciwciałami blokującymi proliferację komórek T zawsze korygowano dla samych PBMC z tym samym inhibitorem lub przeciwciałem blokującym. Test ELISA na cytokiny. IFN-. i wytwarzanie IL-13 mierzono za pomocą testu ELISA typu sandwich według producentów. zalecenia (Sanquin). Granica wykrywalności wynosiła 2 pg / ml. PBMC, barwienie metodą cytometrii przepływowej PBMC. Po 2 dniach hodowli, PBMC stymulowano albo pożywką kontrolną albo 20 ng / ml PMA i 3 ug / ml jonomycyny przez 6 godzin; 10 .g / ml Brefeldyny A dodano po godzinie. Komórki zabarwiono na lodzie dla markerów powierzchniowych CD4 i CD8, utrwalono, permeabilizowano i wybarwiono anty-IFN-y. FITC i przeciwciało anty-IL-4 PE w temperaturze pokojowej. Komórki przemyto przed analizą na FACSCalibur (Becton Dickenson). Mikroskopia. Hodowle sortowanych neutrofili CD62Ldim (znakowanych CD16 FITC) i nieznakowanych PBMC w obecności PHA (10 .g / ml) uzupełniono 50 .M Amplex Red i 0,5 U / ml HRP. W ciągu 4 godzin interakcje neutrofili i limfocytów zobrazowano za pomocą mikroskopu Zeiss LSM510 Meta. W celu oznaczenia ilościowego, neutrofile sortowane CD62Ldim i CD16dim barwiono za pomocą 1. M kalceiny przez 20 minut w 37 ° C. Zamiast Amplex Red zastosowano Amplex UltraRed (50 .M) do tych eksperymentów. Interakcje obrazowano przez średnio 3 godziny przy użyciu mikroskopu do dekonwolucji (Applied Precision DeltaVision Core Imaging System, stosowanym aparatem był Cascade EMCCD). Następnie interakcje zostały policzone przez oko; osoba licząca interakcje była zaślepiona na różne warunki. Statystyka. Dane analizowano przy użyciu Graphpad Prism 4.0. Do porównania różnych punktów czasowych użyto ANOVA z wielokrotnymi pomiarami. Do porównania grup wykorzystano test tony Wilcoxona lub test t-pair z dwoma ogonami. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za znaczącą. Zatwierdzenie badania. Protokół badania dotyczący wyzwań związanych z endotoksem ludzi został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Centrum Medycznego Uniwersytetu Nijmegen Radboud i jest zgodny z Deklaracją Helsińską oraz wytycznymi Dobrej Praktyki Klinicznej. Wolontariusze wyrazili pisemną świadomą zgodę. Komitet ds. Etyki Uniwersytetu Medycznego w Utrechcie zatwierdził protokół badania dotyczący pacjentów z ciężkimi obrażeniami ujętymi w tym badaniu. Pacjenci wyrazili świadomą zgodę po pobraniu krwi zgodnie z protokołem badań. Materiały uzupełniające Zobacz Suplementowe dane Zobacz wideo uzupełniające Podziękowania Autorzy pragną podziękować Bart Ramakers, Matthijsowi Koxowi, Janowi Pompe, Mirrin Dorresteijn, Jenneke Leentjens i Tijn Bouw za wykonywanie wyzwań związanych z endotoksyną u ludzkich ochotników. Jesteśmy wdzięczni Janowi van der Lindenowi, Jeroenowi Langereisowi i Adele Lo Tam Loi za przeprowadzenie eksperymentów. Dziękujemy Gerritowi Spierenburgowi, Koosowi Gaiserowi, Ger Arkesteijn, Corneli van Aalst i Deonowi Kantersowi za pomoc przy sortowaniu FACS. Dziękujemy René Lutter za prezenty od odczynników i Jolanda de Vries za korzystanie z zaplecza laboratoryjnego w Nijmegen. Jesteśmy wdzięczni za fachową wiedzę i wsparcie Centrum Mikroskopii Komórkowej w Utrechcie. Na koniec dziękujemy Linde Meyaard i Dirkowi Roosowi za krytyczne przeczytanie rękopisu. Badanie to przeprowadzono w ramach holenderskiego projektu Top Institute Pharma T1-201-1 (przejście do stanu zapalnego układowego w patologię wielonarządową). Jest to współpraca trzech uniwersytetów (University Medical Center Utrecht, University Medical Center Groningen i Maastricht University), 4 firm farmaceutycznych (AstraZeneca, GlaxoSmithKline, Nycomed BV i Danone Research) oraz holenderskiego rządu Ponadto badanie to zostało wsparte nieograniczonym grantem badawczym od GlaxoSmithKline oraz dotacji z holenderskiej fundacji Asthma (NAF 3.2.10.052). Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2012; 122 (1): 327. 336. doi: 10.1172 / JCI57990.
[podobne: duszniki zdrój sanatorium, taniec użytkowy kroki, tabletki na erekcję bez recepty ]
[patrz też: rowatinex cena, relewium, ada obrazy ]