Patogenna Escherichia coli zwiększa Cl wydzielanie z nabłonka jelitowego przez zwiększenie ekspresji receptora galaniny-1 cd

Zaprojektowaliśmy mimikę za pomocą niepowiązanego segmentu DNA o długości 289 pz i zmodyfikowaliśmy go, zmieniając 5. i 3. kończy się tak, że są homologiczne do 2 regionów w sekwencji kodującej ludzki cDNA Gal1-R. Te 2 regiony mają 210 par zasad na cDNA Gal1-R i obejmują obszar kodujący trzecią pętlę wewnątrzkomórkową. Ponieważ region ten obejmuje lokalizację intronu, amplifikacja za pomocą starterów skierowanych do tych 2 regionów pozwala na gotowe różnicowanie między ciałami mimicznymi (289 pz), cDNA Gal1-R (210 pz) i genomowym DNA. We wszystkich przypadkach oceniano identyczne liczby komórek T84, ponieważ wyekstrahowaliśmy całkowity komórkowy RNA z komórek T84 hodowanych do konfluencji w 24-studzienkowych płytkach. Całkowity RNA został zmierzony i poprawiony, aby zapewnić, że identyczne ilości wiadomości zostały ocenione na studzienkę. Odwrotna transkryptaza w obecności losowych heksamerów została następnie użyta do konwersji RNA do cDNA, a amplifikację przeprowadzono w obecności różnych znanych stężeń mimetyku. Wiążące badania. Komórki T84 hodowano do bliskiego konfluencji w 6-studzienkowych płytkach, a badania wiązania z użyciem [125I] galaniny przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (7). W przypadku wszystkich eksperymentów nienasycone wiązanie stanowiło mniej niż 15% całkowitego wiązania, przy czym wszystkie wartości w tym artykule podano jako wiązanie zdolne do nasycenia. Stworzenie i ocena przeciwciała Gal1-R. Pierwotnie otrzymaliśmy specyficzne przeciwciało anty-peptydowe Gal1-R (numer 96125) od Johna Walsha (CURE / Centrum Biologii Gastroenterycznej, University of California. Los Angeles, Los Angeles, Kalifornia), który szeroko scharakteryzował ten odczynnik w badaniach wstępnych ( 17, 18). To przeciwciało jest skierowane na sekwencję CNESMGDAKEKN, umiejscowioną w bliższej części końca C10H Gal1-R. Ponieważ sekwencja ta znajduje się w regionie, który ma mniej niż 35% homologii na poziomie aminokwasów z podtypami receptora galaniny-2 i galaniny-3, jest on specyficzny dla Gal1-R. Przeciwnie, to przeciwciało jest użyteczne dla różnych gatunków, ponieważ sekwencja, do której jest skierowany, jest w 100% zachowana dla ludzkiego, mysiego i szczurzego Gal1-R. Nasze wstępne badania wykazały, że jest to silne i specyficzne przeciwciało; w związku z tym zakontraktowaliśmy z Research Genetics (Huntsville, Alabama, USA) w celu wytworzenia króliczego przeciwciała przeciw-peptydowego przy użyciu tego samego epitopu. Aby ocenić to przeciwciało (nr 85425), przeprowadziliśmy immunohistochemię przeciw trzustce myszy, ponieważ badania fizjologiczne wykazały, że tylko komórki wysp trzustkowych, a nie acini, eksprymują receptory dla galaniny (19, 20). We wszystkich przypadkach przeprowadzono immunohistochemię przy użyciu 3-etapowej techniki pośredniej immunoperoksydazy opisanej poprzednio (21). Kontrolne tkanki przetwarzano identycznie, z tym wyjątkiem, że nie były one eksponowane na pierwszorzędowe przeciwciało; związane przeciwciało wykrywano przez inkubację szkiełek za pomocą Liquid DAB Substrate-Chromogen System (DAKO Corp.). Aby ocenić swoistość przeciwciała, przeprowadziliśmy analizę Western blot, aby wykryć Gal1-R w komórkach T84, stosując protokół zmodyfikowany z tego, który został opisany wcześniej (22). W szczególności porównaliśmy niezakażone komórki T84 z tymi, które były zakażone EHEC przez godzinę, leczono antybiotykami, a następnie badano 24 godziny później. Infekcja myszy C57BL / 6J przez zgłębnik. EHEC hodowano aż do wzrostu w połowie kłody (OD600 0,1. 0,2), jak opisano wcześniej (23). Patogeny osadzono i zawieszono w 1,2 M fosforanie sodu (pH 8,0) i w przybliżeniu 2 x 105 drobnoustrojów w 200 ul wprowadzono do lekko znieczulonego zwierzęcia przez zgłębnik, stosując igłę o długości 10 cm zakończoną teflonem. Myszy trzymano następnie w klatkach do mikronizatora z wolnym dostępem do pożywienia i wody. Aby zminimalizować zawartość kału w jelitach w czasie badania, na 24 godziny przed poświęceniem, wyeliminowano dostęp zwierząt do żywności. Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Używania na Uniwersytecie Illinois w Chicago zatwierdził to badanie. Testy elektrofizjologiczne dla hodowanych komórek. Jak opisano wcześniej (7), komórki T84 hodowano do konfluencji w Transwells; stosowano tylko te komórki, które wykazują wysokie międzymięśniowe oporności, zgodne z obecnością nienaruszonych ciasnych połączeń (tj.> 1000. cm2). Komórki stymulowano wskazanym środkiem, a Isc oznaczano co 30 sekund w zmodyfikowanej komorze Ussinga. Przepalenie elektryczne przeznabłonkowe obliczono za pomocą prawa Ohma (R = V / I), w którym zmierzono różnicę potencjałów w odpowiedzi na upływ 25 A prądu przemiennego za pomocą uproszczonego urządzenia opisanego poprzednio (24). Testy elektrofizjologiczne dla wyciętych tkanek okrężnicy. Po uśmierceniu przez uduszenie CO2 proksymalną mysią okrężnicę wycięto i umieszczono natychmiast w komorze Ussinga
[więcej w: betaserc opinie, rowatinex cena, duszniki zdrój sanatorium ]
[przypisy: betaserc opinie, rowatinex cena, relewium ]