Patogenna Escherichia coli zwiększa Cl wydzielanie z nabłonka jelitowego przez zwiększenie ekspresji receptora galaniny-1 ad

Chociaż komórki nabłonkowe wyściełające okrężnicę mysią normalnie nie eksprymują Gal1-R, pomimo ciągłego kontaktu z normalną florą okrężnicy, zakażenie EHEC aktywuje NF-kB i powoduje ekspresję nowego Gal1-R de novo. Okrężnice myszy zainfekowanych EHEC zwiększają prąd zwarciowy (Isc) w odpowiedzi na galaninę, gdy są oceniane w komorze Ussinga. Ogólnie, obserwacje te wskazują, że zmiany w ekspresji Gal1-R indukowane przez enterogenu odpowiadają nowatorskiej ścieżce jednoczącej, stanowiącej znaczną część nadmiernego wydzielania płynu związanego z zakaźną biegunką. Metody Odczynniki. Bakterie chorobotwórcze (EHEC, EPEC, ETEC) zostały hojnie dostarczone przez J. Kaper (Center for Vaccine Development, University of Maryland, Baltimore, Maryland, USA); niepatogenne E. coli wyizolowano z flory kałowej zdrowych ludzkich ochotników; a komórki T84 zostały dostarczone przez K. Barretta (University of California. San Diego, San Diego, California, USA). Samce myszy C57BL / 6J wolne od patogenu (6. 8 tygodni) pochodziły z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA). Przeciwciało przeciwko podjednostce p65 NF-kB, które wykrywa biologicznie aktywną cząsteczkę (15) pochodziło od Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Niemcy) i było stosowane w rozcieńczeniu 1: 200 zgodnie z zaleceniami producenta. Wszystkie odczynniki wymagane do immunohistochemii pochodziły od DAKO Corp. (Carpinteria, California, USA). Wszystkie materiały do hodowli tkankowych, w tym Transwells, pochodziły z Corning-Costar Corp. (Cambridge, Massachusetts, USA). Galanina pochodziła z Bachem California (Torrance, Kalifornia, USA), podczas gdy [125I] galanina i wszystkie inne radionukleotydy pochodziły z Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, Illinois, USA). Polimerazę Taq uzyskano z Perkin-Elmer Applied Biosystems (Foster City, Kalifornia, USA), a polimerazę pfu otrzymano ze Stratagene (La Jolla, Kalifornia, USA); wszystkie inne enzymy pochodziły z Promega Corp. (Madison, Wisconsin, USA). RNA Stat-60 pochodzi z firmy Tel-Test Inc. (Friendswood, Texas, USA). Wszystkie oligonukleotydy zostały zsyntetyzowane przez GIBCO BRL (Gaithersburg, Maryland, USA), podczas gdy wszystkie przeciwciała pochodziły z Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, Kalifornia, USA). O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie inne dostawy pochodziły od Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Infekcja monowarstw komórek T84. W tych badaniach, monowarstwy komórek T84, hodowane do konfluencji w Transwells lub 24-studzienkowych płytkach, infekowano bakteriami w fazie wzrostu połowy loga w stosunku około 100 organizmów na komórkę przez godzinę, jak opisano wcześniej (16). Po tym czasie bakterie zostały zabite przez dodanie gentamycyny (50 .g / ml) przez godzinę. Podejście to zastosowano w celu wyeliminowania czynników zakłócających, takich jak kwaśne pH i niedobór składników odżywczych związanych z dłuższym czasem infekcji. Badania zmiany żelu. Poprzednio zidentyfikowano 2 funkcjonalne miejsca rozpoznawania NF-kB w 5. region flankujący ludzkiego genu GAL1R przy użyciu genu reporterowego dla acetylotransferazy chloramfenikolu (14). Sekwencje nukleotydowe tych 2 miejsc różnią się znacznie od siebie, wykazując jedynie 45% homologii. Sekwencja bardziej górnego miejsca, znajdującego się w odległości ~ 809 pz od miejsca inicjacji translacji, to GGG GGG GAT CC; sekwencja bardziej położonego poniżej miejsca, znajdującego się przy A 269 pz, jest GGG GAT TCC CA (14). Aby ocenić udział każdego z tych miejsc NF-kB w regulacji ekspresji mRNA Gal1-R, przeprowadziliśmy badania przesunięć w żelu z użyciem oligonukleotydów komplementarnych do każdej sekwencji. Dla każdego miejsca wygenerowano oligonukleotyd zawierający odpowiednią sekwencję pokazaną powyżej; sekwencję powtórzono w trzech powtórzeniach w celu zwiększenia zdolności wiązania białka jądrowego. Oligonukleotydy oczyszczono na żelu, a następnie znakowano na końcu, aby uzyskać aktywność właściwą większą niż 108 cpm / kg. Oznakowane oligonukleotydy połączono z białkami jądrowymi z kontrolnych komórek T84 lub z zakażonych wskazanymi organizmami przez godzinę. Białka jądrowe otrzymano w sposób opisany uprzednio (9); podzielona na równe części; i przechowywany w temperaturze. 70 ° C. Reakcje wiązania przeprowadzono w temperaturze pokojowej przez 30 minut, stosując 5 .g białek jądrowych i 0,5 ng (25000 cpm) znakowanego oligonukleotydu. Rozdzielanie produktu osiągnięto przez elektroforezę roztworu reakcyjnego na pionowym 5% nie uwycępniającym żelu poliakrylamidowym. Zastosowano testy Supershift w celu określenia, które podjednostki NF-kB zostały aktywowane. W tych badaniach przeprowadzono przesunięcia żelu, jak opisano powyżej, z tym wyjątkiem, że króliki przeciwciał (1 .g / reakcja) przeciwko podjednostkom NF-kB p50, p52, p65, c-Rel i RelB dodano podczas okresu reakcji wiązania. Ilościowa PCR. Oznaczono ilość mRNA Gal1-R przez ilościową reakcję PCR, przeprowadzoną z zastosowaniem mimetyku
[podobne: taniec użytkowy kroki, jak długo gotować ciecierzycę, przegladarka skierowan na leczenie ]
[podobne: ile kalorii ma chleb orkiszowy, seronil ulotka, jak długo gotować ciecierzycę ]