Kluczowa rola kaspazy-3 w osteogennym różnicowaniu zrębowych komórek macierzystych szpiku kostnego czesc 4

Traktowaliśmy BMSSC z TGF-. i badali odpowiednio replikacyjne starzenie i apoptozę. Zaobserwowaliśmy, że TGF-. indukował przyspieszone replikacyjne starzenie w Casp3. /. i Casp3 + /. BMSSC, jak oceniono przez barwienie a-galu (Figura 4A). W przeciwieństwie do tego, traktowanie BMP-2 nie indukowało zwiększonego starzenia się w Casp3. /. lub Casp3 + /. BMSSC (dane niepokazane), co wskazuje, że był TGF-. specyficzność w procesie starzenia. Barwienie aneksyn V wykazało, że Casp3. /. BMSSC wykazywały obniżony poziom apoptozy w obecności TGF-a. (Figura 4B). Nawet w przypadku braku TGF-. leczenie, zarówno Casp3. /. i Casp3 + /. BMSSC wykazały zmniejszone podwojenie populacji wraz z cechami morfologicznymi starzenia, takimi jak powiększone komórki i nieprawidłowe jądra (Figura 4C). Aby wyjaśnić mechanizm, w którym TGF-. przyspiesza starzenie się w Casp3. /. BMSSC, zbadaliśmy udział białek sygnałowych, w których pośredniczy TGF-a i białek związanych z cyklem komórkowym. Casp3. /. BMSSC wykazały podwyższoną ekspresję TGF-a receptor typu I (TGF-aRI) i Smad2 w warunkach normalnej hodowli. Po TGF-. traktowanie, ekspresja Smad2 i fosforylowanego Smad2 (p-Smad2) była regulowana w górę w porównaniu z ekspresją WT BMSSC (Figura 4D), która wskazuje, że szlak TGF-y / Smad2 był nadaktywowany w Casp3. /. BMSSCs. Przeciwnie, TGF-aRII i Smad3 nie były regulowane w górę w Casp3. /. BMSSC (rysunek 4D). Co więcej, ekspresja cyklinozależnej kinazy 2 (Cdk2) i cyklu podziału komórkowego 2 (Cdc2) były obniżone w Casp3. /. BMSSCs, podczas gdy ekspresja ich odpowiedników, p21 i p53, była podwyższona (Figura 4D), co może być jednym z mechanizmów prowadzących do zatrzymania cyklu komórkowego i ostatecznego starzenia się replikacyjnego. Nie wykryliśmy ekspresji p21 w WMS BMSSCs przez 3 dni po TGF-a. leczenie (Figura 4D), chociaż ekspresja p21 stała się wykrywalna w WT BMSSCs po 7 dniach TGF-a. leczenie (dane nie pokazane). Co ciekawe, nawet przy braku TGF-. leczenie, podwyższone poziomy TGF-aRI, Smad2, p21 i p53 wraz z obniżoną wartością Cdc2 znaleziono w Casp3. /. BMSSC (rysunek 4D). Dane te sugerowały, że niedobór kaspazy-3 powodował nadmierną aktywację TGF-a. szlak sygnalizacji i tłumienie cyklu komórkowego w BMSSC. Figura 4 TGF-y związane z replikacyjnym starzeniem się BMSSC z niedoborem kaspazy-3. (A) Replicatywne starzenie się oceniane na podstawie barwienia a-galu. Reprezentatywne obrazy komórek a-gal-dodatnich indukowane przez TGF-a są wyświetlane w górnym panelu (strzałki). Oryginalne powiększenie, × 200. Starzenie się replikacji zostało zwiększone w Casp3. /. BMSSC w porównaniu z WT BMSSC (dolny panel; n = 6; * P <0,001). TGF-. przyspieszone starzenie się w BMSSCs z niedoborem kaspazy-3 (P <0,01, P <0,05), ale nie u myszy WT. (B) Barwienie aneksyną V BMSSCs. Stwierdzono, że liczba komórek aneksyny V. Dodatnich jest podobna w przypadku każdego genotypu w normalnych warunkach hodowli (., Górne panele). Jednak TGF-. leczenie zmniejszyło liczbę aneksynowych V-dodatnich komórek w Casp3. /. BMSSC (+, dolne panele). Komórki zawierające aneksyn V-dodatni pojawiają się na zielono. Oryginalne powiększenie, × 200. (C) Podwojenie populacji BMSSC. BMSSC pasażowano w sposób ciągły w tej samej gęstości komórek po konfluencji. Pięćdziesiąt dni po rozpoczęciu hodowli, Casp3. /. BMSSC przestały namnażać się i wykazywały powiększone komórki i jądra komórkowe, chociaż WT BMSSC kontynuowały proliferację (górne panele). BMSSC z niedoborem kaspazy-3 (3 wykazywały zmniejszone podwojenie populacji (dolny panel) (n = 6; * P <0,001; P <0,01). (D) Analiza Western blot BMSSC. Casp3. /. BMSSC wykazały podwyższoną ekspresję TGF-aRI, Smad2, p21 i p53 wraz z obniżoną ekspresją Cdc2 w porównaniu z WT. Po TGF-. traktowanie, ekspresja TGF-PRI, Smad2, p-Smad2, p21 i p53 była dalej regulowana w górę, towarzysząc obniżonej ekspresji Cdk2 i Cdc2. Wyrażenia Smad3 i TGF-. RII nie zostały zmienione w Casp3. /. BMSSC nawet z TGF-. leczenie. Dziesięć mikrogramów białka zastosowano na każdą ścieżkę, a HSP90 zastosowano jako dodatkową kontrolę dla obciążenia białkiem. Następnie zbadaliśmy udział głównego białka osteogenicznego, Runx2 / Cbfa1, w osteoprogenitorach pochodzących od mysich calvariae. Znaleźliśmy znaczący spadek ekspresji Runx2 / Cbfa1 w Casp3. /. i Casp3 + /. preosteoblasty (Figura 5). Po TGF-. leczenie, ekspresja Runx2 / Cbfa1 była znacząco podwyższona w Casp3 + /. BMSSCs 24 godziny po leczeniu. Przy ciągłym leczeniu przez 7 dni wystąpiła obniżona ekspresja Runx2 / Cbfa1 w WT i Casp3 + /. BMSSCs. Co ciekawe, TGF-. nie był w stanie zmienić wyrażenia Runx2 / Cbfa1 w Casp3. /. BMSSCs. W przeciwieństwie do tego, traktowanie BMP-2 nie indukowało żadnej różnicowej ekspresji Runx2 / Cbfa1 w preosteoblastach myszy z niedoborem kaspazy-3 (dane nie pokazane), co sugeruje, że TGF-a. specyficznie zmienione wyrażenie Runx2 / Cbfa1. Figura 5 Ekspresja RUNx2 / Cbfa1 w preosteoblastach za pomocą analizy Western blot [przypisy: duszniki zdrój sanatorium, diohespan forte, przechowywanie dokumentacji medycznej ] [przypisy: diohespan forte, ile kalorii ma chleb orkiszowy, seronil ulotka ]