Kluczowa rola kaspazy-3 w osteogennym różnicowaniu zrębowych komórek macierzystych szpiku kostnego ad 7

Bardziej znaczący wpływ zaobserwowano w kościach myszy OVX niż myszy operowanych pozornie. To odkrycie sugeruje, że Casp3Inh może silnie wpływać na komórki o wysokich obrotach, takie jak osteoprogenitory u kobiet po menopauzie. Potwierdziliśmy również, że Z-DEVD-FMK blokuje aktywność kaspazy-3 i hamuje różnicowanie osteogenne w ludzkich BMSSCs. Dane te sugerują konieczność starannego rozważenia wszelkich zastosowań Casp3Inhs, szczególnie u kobiet po menopauzie. W tym badaniu stwierdziliśmy, że aktywność kaspazy-3 była wymagana do funkcjonalnego różnicowania BMSSC. Zwiększone starzenie replikujące i zmieniona ekspresja Runx2 / Cbfa1 poprzez zwiększoną ekspresję TGF-. / Smad2 mogą przyczyniać się do upośledzonego różnicowania osteogennego BMSSCs. Podsumowując, kaspaza-3 odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu zarówno rozwoju kości, jak i metabolizmu. Wpływ Casp3Inhs na BMD powinien być brany pod uwagę w przypadku dalszego zastosowania klinicznego. Metody Zwierzęta. Generacja Casp3. /. myszy zostały opisane wcześniej (3). W celu dynamicznej analizy histomorfometrycznej kości, kalceinę (20 mg / kg masy ciała, Sigma-Aldrich) wstrzyknięto dootrzewnowo trzytygodniowym myszom (w odstępie 3 dni), aby oznaczyć aktywnie tworząc powierzchnie kostne. Casp3Inh (Z-DEVD-FMK, 10 mM, BioVision Inc.) rozpuszczony w DMSO wstrzyknięto dootrzewnowo 12-tygodniowym myszom C3H (The Jackson Laboratory) w dawce 0,4 l / g masy ciała dwa razy w tygodniu przez 2 godziny. tygodnie rozpoczynające się 2 dni po wycięciu jajników. Równą objętość DMSO wstrzyknięto jako kontrolę. Myszy uśmiercono 4 tygodnie po wycięciu jajników. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez NIDCR Animal Care and Use Committee w NIH. Kultura myszy BMSSCs. Komórki szpiku kostnego myszy (1 × 2 × 107) zebrane z długich kości wysiano do 100-milimetrowych płytek hodowlanych, inkubowano przez 3 godziny w 37 ° C, aby umożliwić przyłączenie adherentnych komórek, a następnie przepłukano dwukrotnie PBS w celu usunięcia nieprzylegających komórek. . Następnie komórki szpiku kostnego (1. 2 x 107) z długich kości świnek morskich dodano do każdej płytki jako komórki odżywcze. W celu zapobieżenia proliferacji w hodowli komórki odżywcze poddano napromienianiu P (Cez-137) za pomocą 6000 cGy za pomocą urządzenia Gammacell-1000 Irradiator (Atomic Energy of Canada Ltd.). BMSSC tworzyły adherentne kolonie po 12-15 dniach hodowli. Pierwotne hodowle przepuszczano w celu zdyspergowania komórek tworzących kolonie (fragment 1). Komórki w pasażu przy konfluencji w przybliżeniu 70% wykorzystano do eksperymentów. Pożywka hodowlana składała się z P-MEM (Gibco BRL, Invitrogen Corp.), 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, Equitech-Bio Inc.), 2 mM L-glutaminy, kombinacji 100 U / ml penicyliny i 100 g / ml streptomycyny (Biofluids Inc.) i 55 | jM 2-merkaptoetanolu (Gibco BRL, Invitrogen Corp.). Do indukcji osteogennej in vitro dodano 2 mM P-glicerofosforan (Sigma-Aldrich), fosforan 2 | 3 L L-askorbinowego kwasu (Wako Pure Chemical Industries Ltd.) i 10 nM deksametazon (Sigma-Aldrich). Kultura przez 6 tygodni. Do eksperymentów TGF-. (R & D Systems Inc.), komórki głodzono surowicą z a-MEM uzupełnionym 2% FBS przez 16 godzin przed traktowaniem 2 ng / ml TGF-a. W przypadku leczenia przez 3 dni komórki inkubowano z TGF-a. w zwykłym medium hodowlanym. Kultura Human BMSSCs. Ludzkie aspiraty szpiku kostnego od zdrowych dorosłych ochotników (w wieku 20. 35 lat) zakupiono od Poietic Technologies Inc. i hodowano jak podano wcześniej (43). Zawiesiny pojedynczych komórek (0,01 – x 105 / studzienkę) BMSSC hodowano w 6-studzienkowych płytkach (Corning Costar Co.) z a-MEM uzupełnionym 15% FBS, 100. M L-askorbinowego 2-fosforanu, 2 mM L-glutamina i połączenie 100 j./ml penicyliny i 100 .g / ml streptomycyny. Po dodaniu Z-DEVD-FMK przy 2. M przez 24 godziny, BMSSC potraktowano TGF-a. przez 24 godziny i zbierano do analizy Western blot; jednakże, w celu wykrycia ekspresji p-Smad2, BMSSC zebrano po TGF-a. leczenie przez 30 minut. Aktywność kaspazy-3 wykrywano za pomocą testu CaspSELECT Caspase-3 Immunoassay (MBL International Corp.) po BMSSC potraktowano staurosporyną w .M przez 4 godziny w obecności lub pod nieobecność wstępnej obróbki Z-DEVD-FMK przez 24 godziny. Osteogenny stan indukcyjny in vitro był taki, jak wcześniej podano (44). Transplantacja BMSSC do myszy z obniżoną odpornością. Około 4,0 x 106 mysich lub ludzkich BMSSC zmieszano z 40 mg proszku ceramicznego HA / TCP (Zimmer Inc.), a następnie przeszczepiono do grzbietowej powierzchni 10-tygodniowych, pozbawionych odporności, beżowych myszy (bg-nu / nu-xid; Harlan), jak opisano wcześniej (45). Przeszczepy zebrane po 8 tygodniach po transplantacji utrwalono w 4% paraformaldehydzie, a następnie odwapniono 10% EDTA (pH 8,0) w celu zatopienia w parafinie.
[przypisy: badanie elektrofizjologiczne, taniec użytkowy kroki, duszniki zdrój sanatorium ]
[patrz też: excedrin migrastop opinie, test ciążowy quixx, skrecenie stawu skokowego ]