GSK-3 jest centralnym regulatorem patologii związanych z wiekiem u myszy ad 9

Stężenie białka w supernatancie oznaczono ilościowo za pomocą oznaczenia białka kwasu bicynchoninowego (nr 23225 z Pierce). Supernatant załadowano do immunoblottingu, o ile nie zaznaczono inaczej. Równe ilości białek poddano SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membrany nitrocelulozowe. Pierwotne inkubacje przeciwciał przeprowadzono przy rozcieńczeniu 1: 1000. Wszystkie inkubacje prowadzono w temperaturze 4 ° C przez noc. Jako przeciwciało wtórne zastosowano Alexa Fluor 680 (Molecular Probes) w rozcieńczeniu 1: 2,500, przez godzinę w temperaturze pokojowej. Błony skanowano za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni Odyssey (LI-COR). Wykrywanie produkcji ponadtlenku. Wytwarzanie nadtlenków w mięśniu sercowym i mięśniach szkieletowych mierzono chemiluminescencją wzmocnioną przez lucigeninę, jak opisano wcześniej (49). W skrócie, homogenaty tkanek umieszczono w buforze lucigenin (5 .Mol / l), a względne jednostki światła (RLU) zmierzono za pomocą luminometru FB 12. Wytwarzanie nadtlenków wyrażono jako RLU na sekundę na mg mokrej tkanki. Echokardiografia. Dwuwymiarowe echokardiograficzne badanie echokardiograficzne przeprowadzono z użyciem sondy 12-mHz (VisualSonics) na myszach znieczulonych przez inhalację izofluranu (1% ~ 1,5%). Przesłuchanie w trybie M zostało przeprowadzone w przymo- cowym rzutowaniu w osi krótkiej na poziomie największego wymiaru końcoworozkurczowego LV (EDD). EDD, wymiar końcowy lewej komory (ESD) i rozkurczowa grubość ściany tylnej lewej komory (LVPW; d) zostały zmierzone i wykorzystane do obliczenia procentowej frakcji ułamkowej (FS), EF i masy LV. Wartości FS i EF zostały wyeksportowane z programu echowego, a masa LV została obliczona za pomocą następującego wzoru: (2 × LVPW; d + EDD) 3. EDD3. Hemodynamika. W przypadku pomiarów hemodynamicznych in vivo, 1,4 francuskiego cewnika z mikromanometrem (numer SPR-671 z Millar Instruments Inc.) wprowadzono do prawej tętnicy szyjnej i wprowadzono do LV myszy, które zostały lekko znieczulone (tj. Utrzymały oddychanie spontaniczne) z tribromoetanolem / hydratem amylenu (2,5% w / v, 8 | il / g wstrzykiwanego dootrzewnowego; Avertin). Parametry hemodynamiczne, w tym ciśnienie skurczowe LV, ciśnienie końcowo-rozkurczowe LV i szybkość wzrostu ciśnienia LV (+ dP / dt i A dP / dt), rejestrowano w trybie zamkniętej klatki piersiowej, zarówno na początku badania, jak iw odpowiedzi na 10 ng izoproterenolu. , podawana przez kaniulację prawej wewnętrznej żyły szyjnej. Analiza mikro-CT. Staw kolanowy analizowano za pomocą mikro-CT, jak opisano wcześniej (50). W skrócie, 6 stawów prawego kolana zebrano od myszy KO i kontroli z miotu, utrwalono w 4% paraformaldehydzie, a następnie poddano analizie mikro-CT (Scanco A CT 40). Strumień autofagiczny. Komórki MEF utrzymywano w DMEM z 10% FBS uzupełnionym 1-glutaminą i penicyliną / streptomycyną. Dorosłe fibroblasty w sercu izolowano od myszy WT i Gsk3a KO, jak opisano wcześniej (51). Metoda oceny tandemowej fluorescencyjnej LC3 puncta przy użyciu Ad-mRFP-LC3 została opisana wcześniej (52). W skrócie, komórki MEF transfekowano Ad-mRFP-LC3 przy 100 MOI przez 24 godziny (dar J. Sadoshima, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Newark, New Jersey, USA). W przypadku głodzenia komórki najpierw przemyto PBS 3 razy, a następnie inkubowano w EBSS (SH30029, Hyclone) przez 4 godziny. W celu zahamowania fuzji autosagomu z lizosomem, MEF potraktowano 50 nmol / l bafilomycyny-A1 przez 4 godziny. Po wyznaczonym traktowaniu komórki przemyto dwukrotnie PBS i utrwalono 4% paraformaldehydem w PBS. Wszystkie obrazy komórkowe uzyskano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego NikE TiE. W celu ilościowego oznaczenia komórek autofagicznych punktowane kropki GFP-LC3 i mRFP-LC3 określono z trzech powtórzeń przez ręczne zliczenie ponad 50 komórek. W tym teście mRFP zachowuje swoją fluorescencję, nawet w kwaśnym środowisku lizosomów, podczas gdy GFP traci swoją fluorescencję. Statystyka. Różnice między grupami danych oceniono pod względem istotności, stosując odpowiednio niesparowany, 2-biegunowy test Studenta lub 1-drogową ANOVA, odpowiednio, i test post-hoc Bonferroni (GraphPad Prism Software Inc.). Powtarzające się pomiary ANOVA zastosowano do oceny statystycznej istotności danych uzyskanych od tych samych zwierząt w wielu punktach czasowych. Analizę przeżycia przeprowadzono metodą Kaplana-Meiera, a różnice między grupami w przeżyciu testowano testem Gehan-Breslow-Wilcoxon. Dane są wyrażone jako średnie. SEM, o ile nie zaznaczono inaczej. W przypadku wszystkich testów P <0,05 uznano za statystycznie istotny. Zatwierdzenie badania. Wszystkie badania z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez IACUC w Temple University School of Medicine. Materiały uzupełniające Zobacz Uzupełniające dane Podziękowania Podziękowania za pracę z dotacji od NHLBI do T Force, grant operacyjny CIHR (12858 FRF) dla J. Woodgetta, grant NIDCR (R03 DE020840-03) dla T. Freemana i American Diabetes Association Junior Faculty Award (1-11-JF-56) dla Y. Wanga. Uznajemy Briana Moore a i Christine Macolino za pomoc w histologii kości i mikro-CT. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2013; 123 (4): 1821. 1832. doi: 10.1172 / JCI64398. [więcej w: przeglądarka skierowań uzdrowiskowych, badanie elektrofizjologiczne, jak długo gotować ciecierzycę ] [patrz też: rowatinex cena, relewium, ada obrazy ]