GSK-3 jest centralnym regulatorem patologii związanych z wiekiem u myszy ad 8

Ogranicza to do wyciągnięcia jakichkolwiek wiążących wniosków dotyczących roli GSK-3 w ogóle i znosi zdolność do analizowania specyficznych ról 2 izoform GSK-3, ponieważ nie istnieją żadne specyficzne dla izoformy inhibitory. Co więcej, szlak przekazywania sygnałów prowadzący do aktywacji autofagii wydaje się być inny, ponieważ nie widzieliśmy żadnego zaangażowania białka TIP60 lub AMPK (dane nie pokazane). Co najważniejsze, patologiczne konsekwencje zmian aktywności GSK-3 i autofagii dla organizmów wielokomórkowych, w tym regulacja starzenia, nie zostały omówione w Lin i in. Podsumowując, uważamy, że nasze badania definiują nową i kluczową rolę GSK-3. w zapobieganiu przedwczesnemu starzeniu się w kilku układach narządów. Pod jego nieobecność mTOR jest konstytutywnie hiperaktywowany, co jest związane z zaburzeniami w autofagii, które mają krytyczne konsekwencje w usuwaniu szczątków komórkowych i żywotności organizmu. Nasze badania otwierają możliwość moderowania niszczących skutków starzenia się poprzez manipulowanie GSK-3 .. Metody Tworzenie Gsk3a. /. Mysz KO została wcześniej opisana (48). Przeciwciała i chemikalia. Zastosowane przeciwciała były skierowane przeciwko (3-keneninie (nr 9562), GSK-3. (nr 9338), GSK-3. (nr 9315) i oba fosforylowane GSK-3. w Ser21 i GSK-3. w Ser9 (nr 9331, wszystkie z Cell Signaling). IRS-1 (nr sc-559) i Beclin-1 / ATG6 (nr sc-48381) pochodziły z Santa Cruz Biotechnology. H2AX fosforylowany w Ser139 (nr 07-164) pochodził z Millipore. LC3 (nr PD014) pochodzi z MBL International. p62 (nr 03-GP62-C) pochodziło z barwienia ARP Inc. P-galaktozydazą. Skrawki tkanki skrawków suszono powietrzem przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Skrawki utrwalono za pomocą 0,2% aldehydu glutarowego, 5 mM EGTA i 2 mM MgCl2 w 0,1 M PB przez 10 minut w 4 ° C. Skrawki następnie przemyto PBS, dwukrotnie za każdym razem po 5 minut, a następnie przepłukano w buforze do płukania Detergentem (2 mM MgCl2, 0,02% Nonidet P-40 i 0,01% deoksycholanu sodu w 0,1 M PBS) przez 10 minut. Skrawki inkubowano w buforze reakcyjnym X-gal (5 mM żelazocyjanku potasu, 5 mM żelazicyjanku potasu, 2 mM MgCl2, 0,02% Nonidet P-40, 0,01% deoksycholanu sodu i mg / ml X-gal w 20 mM buforze Tris, pH 6,0) przez noc w 37 ° C, a następnie przemywano PBS, dwukrotnie przez 5 minut za każdym razem. Skrawki następnie umieszczono w 10% formalinie lub 4% paraformaldehydzie na 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyto je PBS, 3 razy po 5 minut za każdym razem, barwiono kontrastowo Nuclear Fast Red (nr H-3403 z Vector Laboratories Inc.) na 3 minuty, przemywano PBS dwa razy przez 2 minuty za każdym razem, a następnie odwadniano serią stężenia etanolu (95%, 3 minuty, 100%, dwa razy przez 3 minuty za każdym razem) i dwukrotnie usuwane ksylenem przez 3 minuty za każdym razem. Prowadnice zostały następnie zamontowane za pomocą stałego nośnika montażowego. Immunohistochemia. Skrawki parafiny poddano deparafinizacji seryjnymi płukankami ksylenowymi i ponownie uwodniono przy seryjnych stężeniach etanolu (stopniowo od wysokich do niskich stężeń). W celu odzyskania antygenu, szkiełka umieszczano w roztworze do odklejania antygenu (nr H-3300 z Vector Laboratories Inc.) zawierającego 0,1% Nodidet P40 do permeabilizacji. Roztwór gotowano przez 10 minut w kuchence mikrofalowej zgodnie z instrukcjami producenta, a szkiełka następnie pozostawiono do ochłodzenia. Skrawki przemywano dwukrotnie PBS przez 5 minut za każdym razem, a następnie inkubowano w 0,3% nadtlenku wodoru w ddH2O zawierającego 0,2% (w / v) azydku sodu w temperaturze pokojowej przez 10 minut w celu wyeliminowania aktywności endogennych peroksydaz. Skrawki inkubowano w buforze blokującym (5% [v / v] normalnej surowicy w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Skrawki inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem w stosunku 1: 250 w buforze blokującym w 4 ° C przez noc. Skrawki przemywano PBS 3 razy przez 5 minut za każdym razem, a następnie inkubowano z EnVision + System-HRP (nr K4002 od Dako) przez 60 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyto PBS, 3 razy po 5 minut za każdym razem, i opracowanie z substratem DAB z zestawu substratu peroksydazy (nr SK-4100 z Vector Laboratories Inc.). Skrawki wybarwiano kontrastowo hematoksyliną QS (nr H-3404 z Vector Laboratories Inc.), a następnie odwadniano za pomocą seryjnych stężeń etanolu i oczyszczano za pomocą seryjnych płukań ksylenowych. Slajdy zostały zamontowane z trwałym materiałem montażowym. Immunoblot. Tkankę LV homogenizowano w 10 objętościach buforu do lizy (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, mM EDTA, 0,25% dezoksycholanu sodu, 1% NP-40), uzupełniono koktajlem inhibitora proteazy i koktajlu inhibitora fosfatazy ( Sigma-Aldrich). Po homogenizacji homogenaty odwirowano przy 12 000 g przez 15 minut i rozdzielono na rozpuszczalny nadsącz NP-40 i nierozpuszczalny osad.
[przypisy: duszniki zdrój sanatorium, ile kalorii ma chleb orkiszowy, najlepsze piosenki dla dzieci ]
[podobne: seronil ulotka, jak długo gotować ciecierzycę, betaserc opinie ]