GSK-3 jest centralnym regulatorem patologii związanych z wiekiem u myszy ad 5

Zatem, prozapalne cytokiny są rzeczywiście zwiększone u myszy KO. Mechanizmy regulujące proces starzenia. Następnie zbadaliśmy potencjalne mechanizmy molekularne leżące u podstaw przyspieszenia starzenia. Zauważyliśmy wzrost ekspresji IRS-1, bezpośredniego celu GSK-3, ale, zgodnie z naszymi wcześniejszymi badaniami (34), nie było to związane ze znacznym wzrostem aktywności Akt, jak określono przez fosforylację seryny-473 Akt (ryc. 7, A i B). Jednakże rozregulowanie funkcji mTORC1 było najbardziej uderzające. Przeanalizowaliśmy sygnalizację mTORC1 u starzejących się myszy i stwierdziliśmy znaczną zwiększoną aktywność u myszy KO, w oparciu o fosforylację celów 3 mTORC1: 4E-BP1, kinazę S6 i rybosomalne białko S6 (Figura 7, C = E). Zbadaliśmy również stan fosforylacji białka 2 stwardnienia guzowatego (TSC2), który hamuje mTOR. Nie znaleziono zmian w fosforylacji TSC2 w T1462, kluczowym miejscu Akt (odnośnik 35 i Dodatkowa Figura 2) lub w S1254, miejscu regulowanym przez p38 MAPK (dane nie przedstawione). Sugeruje to, że ani szlak Akt, ani p38 nie są głównymi czynnikami przyczyniającymi się do zwiększenia aktywności mTORC1 obserwowanej u myszy KO. Figura 7 Dysregulacja szlaków sygnałowych w sercach myszy GK3a KO. Immunobloty 2-letnich serc WT i Gsk3a KO dla różnych ścieżek sygnałowych, w tym (A) IRS-1; (B) phospho-Akt S473 i Akt; oraz docelowe 3 mTOR (C) 4E-BP1, (D) kinaza p70S6 i (E) rybosomalne białko S6. GAPDH służył jako dodatkowa kontrola obciążenia we wszystkich immunoblotach. Biorąc pod uwagę centralną rolę mTORC1 w regulacji autofagii i kluczową rolę autofagii w starzeniu, ocenialiśmy autofagię w sercach myszy KO i WT przez kwantyfikację ekspresji markerów autofagii beclin-1 (ATG6), LC3-I / II, i p62. Ekspresja Beclin-1 była bardzo widoczna w sercach myszy WT w wieku 6 miesięcy, ale była w znacznym stopniu zmniejszona w sercach KO, co sugeruje upośledzenie lub zmniejszenie autofagii (pozycje 36, 37 i figura 8A). Zgodnie z tym, stosunek LC3-II do LC3-I dramatycznie zmniejszył się u myszy KO w porównaniu z myszami WT, co było szczególnie wyraźne u myszy 12- i 24-miesięcznych (Figura 8A). Wreszcie, ekspresja p62 była znacznie zwiększona u 12- i 24-miesięcznych myszy KO (Figura 8A). Tak więc te 3 markery autofagii są zgodne z upośledzoną autofagią u myszy KO, zwłaszcza gdy się starzeje. Figura 8 Zmniejszona autofagia w sercach myszy GK3a KO. (A) Immunoblot dla poziomów LC3-I i LC3-II u myszy WT i KO. Zwróć uwagę na wyraźnie niższe poziomy LC3-II u myszy KO w porównaniu z myszami WT i wyższe poziomy LC3-I u myszy KO w porównaniu z myszami z WT, szczególnie widoczne w 12- i 24- stare myszy. Poziomy Beclin-1 (ATG6) są zmniejszone, podczas gdy poziomy p62 są zwiększone u myszy KO, szczególnie w 12 i 24-miesięcznych punktach czasowych. Immunobloty są zgodne z zaburzoną autofagią u myszy KO. (B) Hamowanie autofagii w MEF potraktowanych inhibitorem GSK-3 (SB216763 [SB]). MEF transfekowano adenowirusem tandem mRFP-GFP-LC3. Komórki głodzono w buforze EBSS w obecności lub nieobecności SB216763, a następnie liczbę żółtych i czerwonych kropek LC3 na komórkę określano ilościowo za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. (C) MEF traktowane jak w D poddano działaniu inhibitora lizosomalnego (bafilomycyna-A1 [BAF]), inhibitora GSK-3 SB216763 lub obu, a ilości LC3 oznaczono ilościowo. (D i E) Kwantyfikacja żółtych i czerwonych kropek LC3 na komórkę z doświadczenia opisanego w B i C. W każdym stanie zliczono ponad 50 komórek, a dane reprezentują 3 niezależne eksperymenty. Pomimo tych odkryć i ogólnego poparcia dla stosowania powyższych biomarkerów autofagii, przyjmuje się, że autofagię należy mierzyć jako zjawisko fluktuacji. zamiast pomiaru statycznego (38). Dlatego wykorzystaliśmy tandemową analizę fluorescencji mRFP-GFP-LC3 w mysich embrionalnych fibroblastach (MEF) potraktowanych małocząsteczkowym inhibitorem GSK-3 (SB216763, Figura 8, B i C, i odn. 39) oraz w fibroblastach dorosłego Gsk3a KO. (Rysunek 8, D i E) w celu ustalenia, czy GSK-3. naprawdę reguluje autofagię. Podsumowując, oba modele były w pełni zgodne z GSK-3. bezpośrednio reguluje autofagię. Zahamowanie GSK-3 za pomocą inhibitora małocząsteczkowego znacznie zmniejszyło liczbę autofagosomalną i autolizosomalną i tym samym upośledził przepływ autofagiczny (figura 8B). Leczenie SB216763 również zmniejszyło liczbę autofagosomów w obecności bafilomycyny A1, inhibitora fuzji autofagosomu-lizosomu (Figura 8C), co sugeruje, że GSK-3 jest również wymagany do tworzenia autofagosomu. Aby jeszcze bardziej potwierdzić rolę GSK-3. w strumieniu autofagicznym przeprowadzono testy tandem mRFP-GFP-LC3 na wyizolowanych fibroblastach WT i GK3a KO dla dorosłych
[więcej w: usuwanie tatuażu warszawa, najlepsze piosenki dla dzieci, tabletki na przyrost masy ]
[podobne: palomed, zofia zborowska wikipedia, chleb orkiszowy kalorie ]